کیت سیتولوژی فاز مایع جهت غربالگری نمونه های سرویکال
مقدمه
در سال 1945 جرج پاپانیکو لائو با چاپ رساله خود تحت عنوان (تشخیص سرطان گردن رحم با اسمیر واژینال) ،روش پاپ اسمیر معمولی را بنیان نهاد. به رغم ارتقاء کیفیت تشخیص سرطان گردن رحم با این روش ،حدود 40 سال استفاده و مطالعه این روش نشان داد که مشکلات عمده ای برای تشخیص زودرس سرطان گردن رحم با این روش وجود دارد. حجم نمونه ناکافی، عدم یکنواختی اسمیر تهیه شده و انباشتگی موکوس، سلولهای خونی و التهابی و همچنین وجود ذرات خارجی موجب ایجاد لام هایی با کیفیت پایین در روش پاپ اسمیر معمولی و لزوم تکرار نمونه گیری در %7.6 تا% 9.1 موارد می شود.
نتایج بالای منفی کاذب ( %55-%2) که به شدت تحت تاثیر نحوه نمونه گیری و آماده سازی اسلاید است باعث کاهش حساسیت این روش برای تشخیص سلولهای غیر نرمال می شود. ( 1،2 ، 6) با استفاده از روش سیتولوژی فاز مایع، اسلایدهایی یکنواخت بدون حضور خون، موکوس و مواد خارجی تهیه می شود که باعث کاهش موارد تکرار نمونه گیری به 1.6% و افزایش حساسیت و اختصاصیت تشخیص موارد LSIL،HSIL نسبت به روش پاپ اسمیر معمولی می شود. ( 2،3،4،5،)
در حال حاضر حدود 80-60% پاپ اسمیرهای بررسی شده در آمریکا و اروپا و تقریبا 100% غربالگری پاپ اسمیر در انگلستان و ولز به روش LBC است.
کاربرد کیت
این کیت جهت غربالگری سیتولوژی سرطان گردن رحم در بانوان و به منظور استفاده در آزمایشگاه تشخیص طبی طراحی شده است. از رسوب سلولی به دست آمده ، می توان برای تشخیص ژنوم عواملی مانند HPV ،HSV و کلامیدیا، نایسریا، ترپونما، تریکوموناس واژینالیس و… استفاده کرد. برای این کار پس از 2 بار شستشوی رسوب سلولی با آب مقطر، با استفاده از کیت مناسب، اقدام به استخراج DNA نموده و سپس PCR انجام دهید.
اساس آزمایش
سلولها پس از نمونه گیری به داخل محلول فیکساتیو که همزمان هموژنایزر موکوس و لیز کننده RBC است منتقل می شود، سپس در کنار محلول Cell Cleaner مخصوص در طی 10 دقیقه سانتریفیوژ در حدود g 1000 سلولها ی موجود در نمونه ( به جز RBC های لیز شده و اجزاء آنها) رسوب کرده و موکوس و مواد اضافی تخلیه می شود. در مرحله بعدی رسوب سلولی با محلول لایه ساز (Layer Maker ) مخلوط شده و با شیکر لوله کاملا یکنواخت می گردد و با استفاده از سمپلر به روی اسلاید منتقل می شود.پس از 3-2 ساعت که خشک شد ، با روش پاپانیکولائو رنگ آمیزی و سپس مونته می شود. در این روش باکتریها و قارچهای رشته ای ومخمری نیز به همراه سلولهای اپیتلیال و WBC ها رسوب کرده و قابل بررسی هستند.
محتویات کیت
1) محلول فیکساتیو: 50 ویال حاوی 10 میلی لیتر محلول پایدار کننده نمونه و هموژنایزر موکوس و لیز کننده RBC (به دلیل استفاده از نوع خاصی پلیمر، ممکن است دارای ذرات معلق باشد.)
2) محلول پاک کننده سلولی(Cell Cleaner) 1ویال حاوی 160 میلی لیتر محلول پاک کننده سلولی که آماده مصرف است.
3) محلول لایه ساز(Layer Maker) : یک ویال حاوی20 میلی لیتر محلول آماده مصرف
4) 50 عددCervex Brush جهت نمونه گیری
5) دستور العمل استفاده و کاربری کیت
توجه: محلولهای موجود در کیت باید کاملا شفاف و بدون رسوب باشند. از مصرف محلولهای کدر و دارای رسوب سفید رنگ یا غیر همگن خودداری کنید.
ملزومات تکمیلی جهت انجام تست پاپ اسمیر
1) سانتریفیوژ
2) میکروسکوپ نوری معمولی
3) شیکر لوله و (ترجیحا) لوله مخروطی
4) سمپلر، پیپت، لام و قلم الماس
5) مواد و تجهیزات رنگ آمیزی پاپانیکولا
نکات قابل ذکر برای مصرف کننده گان
1) محتویات کیت حاضر جهت استفاده در همین کیت طراحی شده است لذا از مخلوط کردن محلول های کیت با کیت هایی که دارای شماره ساخت متفاوت هستند خودداری کنید.
2) هیچ یک از محلولهای این کیت منشاء سرمی ندارند اما به دلیل استفاده از مواد فیکساتیو ممکن است باعث بروز آلرژی، خارش ،سوزش و ... شوند، بنابراین از تماس پوست یا چشم با این محلولها خودداری کرده و در صورت تماس ، با مقدار فراوانی آب شستشو کنید.
3) در صورت ریخته شدن این محلولها بر روی زمین یا میز کار، با استفاده از یک پارچه خشک اقدام به جمع آوری نموده و سپس با آب فراوان محل را پاک کنید.
شرایط نگهداری و پایداری کیت
1) محتویات کیت را در دمای اتاق 30-15 درجه سانتیگراد نگهداری کنید.
2) محتویات کیت را در معرض تابش مستقیم نور آفتاب یا لامپ UV قرار ندهید و در جعبه اصلی خود نگهداری نمایید.
3) از قرار دادن کیت در کنار دستگاههای حرارت زا خودداری کنید.
4) پایداری محتویات کیت تا پایان مدت انقضای یاد شده برروی هریک از آنها میباشد.
توضیحات عمومی مهم
1)قبل از شروع مراحل آزمایش ،تمام مواد ونمونه ها را آماده کرده وتعداد لازم از لوله های cc 15آزمایش مخروطی را در رک مناسب قرار دهید وپس از شماره گذاری 3 میلی لیتر محلول Cell Cleaner به هر یک از لوله ها اضافه کنید.
2)برای کسب نتایج بهتر تمامی مراحل را به طور منظم وپشت سر هم انجام دهید.
3)قبل از اضافه کردن نمونه به محلول Cell Cleaner موجود در لوله ها ،نمونه ها را حداقل به مدت 20 ثانیه د رشیکر لوله مخلوط نمایید.
4)سرعت چرخش سانتریفیوژ یونیورسال معمولی از 3200-2800 RPM نباید تجاوز کند.
5)بلافاصله پس از انجام سانتریفیوژ اقدام به خالی کردن لوله ها نمایید.در غیر این صورت مقداری از رسوب سلولی سست شده و در موقع تخلیه کردن به همراه مواد اضافه تخلیه می شود.
6)پس از سانتریفیوژ وتخلیه مواد اضافی لوله ها، مایع اضافی موجود در لبه لوله ها را با تماس دادن به یک دستمال کاغذی حذف نمایید.
7)پس از اضافه کردن محلول لایه ساز حداقل 20ثانیه لوله ها را در شیکر لوله مخلوط کنید.این مرحله برای به دست آوردن یک اسمیر سلولی یک لایه ویکنواخت بسیار حیاتی است.
جمع آوری نمونه
برای انجام نمونه گیری پزشک یا ماما در مطب با استفاده از اسپکولوم و برس Cervex brush اقدام به نمونه گیری می کنند. بلافاصله پس از نمونه گیری قسمت برس مانند را جدا کرده و داخل محلول فیکساتیو منتقل می نمایند. نمونه حداقل به مدت 2ماه در دمای اتاق و داخل فیکساتیو پایدار است. توجه نمایید که برای استفاده از تمام محتوای سلولی نمونه گیری شده ، لازم است قسمت سفید رنگ برس را از دسته جدا کرده و درون ویال بیندازید. به این منظور اندازه دهانه ظرف فیکساتیو طوری انتخاب شده است که پس از ورود سر براش به داخل ویال می توان به راحتی آن را از دسته براش جدا کرد. برای جدا کردن سر براش و جلوگیری از ایجاد آلودگی ، پس از نمونه گیری ، سر براش را درون ویال قرار داده و پس از گیر دادن لبه براش به کناره داخلی ویال ، دسته آبی رنگ براش را بکشید تا دو قسمت از هم جدا شوند.
موارد مهم در نمونه گیری
1) از نمونه گیری در زمان خونریزی ماهانه اجتناب کنید.
2)حداقل 3 روز قبل از نمونه گیری از نزدیکی کردن بپر هیزید.
3)از انجام نمونه گیری در طی 3 روز پس از استفاده از کفها و ژلهای ضد اسپرم، پمادهای درمانی و... خودداری کنید.
4)در صورت ضرورت نمونه گیری در نمونه های دارای خون ریزی ، از انتقال لخته های خون به محلول فیکساتور خودداری کنید.
مراحل انجام آزمایش
1) قبل از انجام آزمایش تمام نمونه ها و مواد مورد نیاز را آماده کرده و به تعداد لازم لوله cc 15 (ترجیحا مخروطی) را در رک مناسب قرار دهید. جهت استفاده از این لوله ها شعاع محور سانتریفیوژ ، حداقل باید 18 سانتیمتر باشد.
2)با استفاده از مارکر مناسب مشخصات نمونه ها را روی لوله ها ی مربوطه بنویسید و درون هر لوله 3میلی لیتر محلول پاک کننده نمونه(Cell Cleaner) اضافه کنید.
3) ویال فیکساتور حاوی نمونه را به مدت 20 ثانیه در شیکر لوله شیک کرده و سپس مقدار 10-8 میلی لیتر از محتوای آن را به لوله شماره گذاری شده منتقل کنید.(این مرحله را به برای هر نمونه به طور جداگانه انجام دهید و از شیک کردن تمام نمونه ها به طور همزمان خودداری نمایید.)
4) لوله ها را در سانتریفیوژ قرار داده و در دور RPM 3200-2800 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ کنید.
5) بلافاصله پس از اتمام سانتریفیوژ ، محلول رویی لوله ها را تخلیه کرده و مایع اضافی موجود در لبه ها را با تماس دادن به یک دستمال کاغذی حذف نمایید.
6) معمولا در این مرحله مقدار 200-100 میکرولیتر رسوب در ته لوله ها باقی می ماند. به مقدار 3 برابر حجم رسوب باقی مانده در ته هر لوله (معمولا 600-300 میکرولیتر) از محلول لایه ساز(Layer maker ) اضافه کنید.
7)به ازای هر نمونه 3-1 لام نو برداشته و با قلم الماس شماره نمونه ها را ثبت کنید.
این مرحله را در یک سطح تمیز و عاری از گرد و خاک انجام دهید و مراقب باشید که سطح لامها با تماس دستکش آلوده وچرب نشود. از به کار بردن لامهای مصرف شده یا چرب خودداری کنید .
8) به منظور تهیه یک اسمیر تک لایه و یکنواخت ، هر لوله را به طور جداگانه حد اقل به مدت 20ثانیه در شیکر لوله مخلوط کرده و بلافاصله با استفاده از سمپلر 25 میکرولیتر و نوک سمپلر یک بار مصرف اسمیر مربوطه را تهیه کنید . برای این کار 50میکرولیتر از سوسپانسیون تهیه شده را در سطح لام قرار داره و با نوک سمپلر در سطح لام پخش کنید.
9) لامهای تهیه شده را در دمای اتاق به مدت3-2 ساعت یا به مدت 20 دقیقه در 45 درجه سانتیگراد قرار دهید تا کاملا خشک شوند.
10) پس از خشک شدن لامها با استفاده از روش پاپانیکولائو ، لامها را رنگ آمیزی کرده و مونته کنید. توجه کنید که استفاده از رنگها و الکلهای تازه و فاقد رسوب در ایجاد یک رنگ آمیزی مناسب ضروری است.
رفرانس ها
1) Kindelberger et al. Acta Cytol. 2006 May-jun;50(3):306-11
2) Guidance on the use of liquid-based cytology for cervical screening. Technology Appiaisal69 october 2003.
3) Liquid based cytology for cervical screening. MSAC reference 12a. Commonwealth Minister for Health andAgeing on 16 October 2002. 2002
4) Austin M. Ramzy I. Acta Cytol 1998;42 178-84
5) Liquid-based cytology in cervical screening:a rapid and systematic review . Health Technology Assessment 2000; Vol.4:No.18
6) جزوه مراحل انجام پاپ اسمیر و نحوه تفسیر پاسخها.مهرگان امامی نایینی معاونت بهداشت دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی واحد بهداشت خانواده
7) آمارحياتی كاربردی، تالیف سید حسن صانعی 1382
8) روشهای آماری و شاخص های بهداشتی، دكتر كاظم محمد- دكتر حسین ملك افضلی 1384